人外周血淋巴細胞分離液推動了實驗發(fā)展

    人外周血淋巴細胞分離液包括淋巴細胞和單核細胞等細胞，其體積、形態(tài)和密度與其他細胞不同，紅細胞和白細胞等細胞密度較大，為1.090 g/ml左右，而淋巴細胞和單核細胞密度為1.075～1.090 g/ml，血小板為1.030～1.035 g/ml。為此，將葡聚糖(右旋糖酐)和泛影酸葡甲胺按一定比例混合，調(diào)整比重、pH值和滲透壓，經(jīng)過澄清及除菌過濾后制成一種密度在1.077g/ml并且近于等滲的人外周血淋巴細胞分離液，經(jīng)過密度梯度離心使一定密度的細胞按相應密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離。

    人外周血淋巴細胞分離液為帶有乳光或微乳光的滅菌水溶液。主要成分是Ficoll 400與泛影酸葡甲胺。人外周血淋巴細胞分離液適用于從血液分離所需細胞，在醫(yī)療和醫(yī)學生物學研究中廣泛應用。其他人及動物多種比重細胞分離液。注：因不同種屬不同比重分離液的細胞離散系數(shù)及細胞帶電不同，所以用戶在定制分離液時應提供所需分離液的比重、動物的種屬及被分離細胞的名稱。將采到的肝素抗凝血取樣計數(shù)白細胞總數(shù)。使用人外周血淋巴細胞分離液將血樣1：1稀釋，混勻時要沿管壁吹出，避免產(chǎn)生氣泡。吹勻后于37℃水浴中平衡。從冰箱中取出4℃避光保存的人外周血淋巴細胞分離液。搖勻后在無菌狀態(tài)下加入刻度離心管中。操作中盡量避免吸管碰觸管壁。原則上分離液的高度不超過管高的1/4。

    將盛有分離液的離心管放入37℃水浴中平衡，用吸管將稀釋的血液沿離心管壁徐徐加到分離液面上，用力要輕，避免血液沖入分離液中，使得稀釋血重疊在分離液面以上，擰緊管蓋。稀釋血與分離液的高度比在1：2-2：1之間。原則上兩者的總高度不超過離心管的2/3。將離心管放置于水平離心機中，室溫下 2000rpm離心20min。離心過程中要觀察離心速度是否正確，且在停止時選擇“no break”，避免因為急劇減速將已經(jīng)分離的單個核細胞層重新弄混。注意離心結(jié)束時的減速過程，不要太快。人外周血淋巴細胞分離液離心結(jié)束后可見管內(nèi)分為四層，從上至下分別為：血漿層（含部分血小板）、白膜層（含單個核細胞及少量血小板）、分離液層、粒細胞及紅細胞層。將吸管輕輕穿過血漿層至白膜層，沿離心管周緣吸出血漿層與分離液層界面間的白膜層細胞，置于新離心管中。盡量少吸取分離液。

    人外周血淋巴細胞分離液注意吹打均勻，不要有細胞團塊。室溫下1500rpm離心5min，洗滌兩次。zui后一次洗滌時定量加入RPMI1640，吹打均勻后取樣計數(shù)細胞，zui后一次離心完畢傾倒出上清液后請請要度離心管，將管底細胞搖勻。根據(jù)上一步的計數(shù)結(jié)果，用含F(xiàn)BS10%-20%、雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液將細胞配成所需濃度。人外周血淋巴細胞分離液的離心管以小管徑為佳，細胞層相對厚，便于淋巴細胞的吸取，2000rpm的相對離心力大概在573g-708g，不同的離心機可以注意計算一下離心力與轉(zhuǎn)數(shù)的關(guān)系。人外周血淋巴細胞分離液離心速度太慢或時間不足時，淋巴細胞層較薄，且在這個層面上有紅細胞混雜；離心速度太快或時間過長時，淋巴細胞層相對分散，會進入下面的分離液層，每次將離心管帶入超凈臺內(nèi)時要用酒精擦拭離心管，尤其管口和管帽。